关于基因合成
一直想介绍一下相关文献的，虽然之前已经放了一两篇在我的“个人文件”里，不过一直没写，正好前两天一位同学来问我这个问题，交流之后又从他那里拿来一篇文献，这样四五篇文献加起来对这个技术算是掌握了大概了。
所谓基因合成就是不用模板，而是以一系列相互overlaping的引物进行“组装”，最后得到完整的目的基因。这适用于克隆一些找不到模板的基因或着在克隆过程中进行稀有密码子的替换、氨基酸的突变等等。所以这项技术虽然比直接从模板上克隆要贵一些，却有着无可替代的好处，将来一定会得到广泛应用。
目前的基因合成技术基本上是基于PCR技术的，较常见的是两步法、一步法和改进的两步法。这里主要推荐两篇文章，一篇是一步法，另一篇是改进的两步法。文献都放在我的个人文件的“分子生物学文献”中了，另外，在http://www.evolvingcode.net/codon/sgd/index.php有第一篇文章的作者设计的在线设计基因合成引物的软件，可以参考，虽然本人更倾向于采用后一种方法，并且觉得在软件设计上也许还有可以改进的地方，但是大家不妨去看看。
两步法要点：每条引物50nt，重叠区10nt。（或3'端重叠10nt，5'端重叠15nt。）。第一轮PCR时不是把所有引物混合，而是分段混合PCR，这样形成重叠区更长的几个大片段，然后在第二轮将纯化的大片段混合后以最两端的引物PCR，得到完整基因。值得注意的是：“两步法”文献中提到使用T7核酸内切酶I来切断配对错误的片段，从而降低出错率。这是一个很好的办法并且在其他方面应该可以有更多的应用。